Определение показателей белкового обмена, иммуноглобулинов и некоторых цитокинов в крови больных сахарным диабетом типа 2

 

Гусейнова Гюнель Рашид кызы,

аспирант кафедры биохимии Азербайджанского медицинского университета.

Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биохимии

Ариф М. Эфендиев.

 

Несмотря на то, что число больных сахарным диабетом (СД) во всем мире больше 100 млн. и тяжесть настоящего социально-экономического положения приводит к васкулярным осложнениям, этиология СД до сих пор не изучена до конца [8].

Исследования последних 10 лет показывают, что воспаление, в особенности провоспалительные цитокины, являются определяющим элементом в развитии сосудистых диабетических осложнений [2].

Целью настоящей работы было исследование в сыворотке крови больных сахарным диабетом типа 2 содержания глюкозы, HbA1c (гликозилированный гемоглобин), показателей белкового обмена, иммуноглобулинов (A, G, M) и цитокинов - ИЛ-8 (интерлейкин-8), ФНО –α (фактор некроза опухоли), ТФР-β₁ (трансформирующий фактор роста).

 

Материалы и методы

 

Исследования проводились в биохимической лаборатории Азербайджанского Медицинского Университета с кровью 76 больных сахарным диабе­том типа 2. Кровь 20 здоровых доноров служила в качестве контроля.

Количество глюкозы определяли ферментативным глюкооксидазным методом го­то­вым реактивным набором «Human» (Германия) [4].

Уровень HbA1с – гликозилированного гемоглобина определя­лся по цветной реакции с тио-барбитуровой кислотой. Принцип метода заключается в том, что эритроциты отмываются от белков плазмы и глюкозы; содержащийся в них гликозилированный гемоглобин гидролизуется нагреванием со щавелевой кислотой, при этом из остатков моносахарида образуется 5-оксиметил-фурфурол, количество которого определяется по цветной реакции с тио-барбитуровой кислотой. Одновременно определяют концентрацию гемоглобина в гемолизате, результаты выражают процентами молекул гемоглобина, которые гликозилированы [3].

Количество общего белка определяли биуретовым методом («Human» Германия). Принцип метода основан на том, что белки в щелочной среде с сульфатом меди образуют сине-фиолетовое окрашивание [5].

Для определения уровня альбумина использовали набор реактивов «Human» (Германия). Принцип метода основан на взаимодействии альбумина с бромкрезоловым зеленым с образованием соединения синего цвета [5].

Концентрацию креатинина в сыворотке крови определяли методом Поппер на основе цветной реакции Яффе с помощью набора реактивов фирмы «Lachema» производства Чехии. В щелочной среде креатинин образует с пикриновой кислотой соединение оранжево-красного цвета [1].

Определение в сыворотке крови мочевины проводили диацетилмонооксимным методом, используя набор реактивов «Lachema» (Чехия). В основе метода лежит способность мочевины образовывать красный комплекс при взаимодействии с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа [1].

Концентрацию иммуноглобулинов определяли методом турбидометрии с помощью тест-систем фирмы «Pars Azmun» (Иран).

Для определения уровня цитокинов в сыворотке крови проводили твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA) с помощью коммерческих наборов соответствующих реагентов фирмы «Bender Medsystems» (Австрия), согласно инструкциям производителей.

Статистическая обработка результатов исследований проведена с использованием программы STATISTICA 6.0. Полученные результаты были подвергнуты вариационному анализу с вычислением средней арифметической и ее ошибки для каждой группы. Достоверность различий между группой больных и контролем оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. При оценке различий показателей между группами взят порог доверительной вероятности не менее 0,95 с уровнем значимости р не более 0,05.

 

Результаты и обсуждение

 

Нами были исследованы некоторые биохимические и иммунологические показатели в сыворотке крови больных СД типа 2. Уровни глюкозы и гликозилированного гемоглобина приведены в таблице 1.

 

 Таблица 1.

Уровень глюкозы и HbA1c в группах.

Группы	Глюкоза, ммоль/л	HbA1c, %
Контроль n=20	3,84±0,13	5,5±0,07
Больные СД n=76	7,78 ± 0,33*	8,26 ± 0,3 *

*р<0,001.

 

Таблица 2 отражает содержание показателей белкового обмена. Как видно из таблицы в крови больных СД типа 2 количество общего белка и альбумина уменьшается, а концентрация креатинина и мочевины наоборот повышается.

 

Таблица 2.

Уровни показателей белкового обмена у больных СД типа 2 и в контрольной группе.

Группы	Общий белок г/л	Альбумин г/л	Креатинин мкмоль/л	Мочевина ммоль/л
Контроль n=20	75,9 ± 0,83	46,09± 0,94	72,73 ± 1,66	5,8 ± 0,08
Больные n=76	65,01 ± 1,3	40,9± 0,65*	223,26± 20,67*	9,63 ± 0,53*

*p<0,001.

 

Отклонения белкового обмена сказываются и на глюконеогенезе из белка, поскольку избыточная продукция глюкозы при диабете отчасти зависит от повышения утилизации образующихся из белка предшественников. У больных диабетом количество азотистых продуктов в мышцах после приема белковой пищи восстанавливается труднее, чем в норме. В процессе превращения белка в углеводы образуется аммиак, мочевина и другие продукты распада. В связи с этим, при нелеченном или декомпенсированном СД возникают процессы, обусловленные усиленным образованием аммиака, как в печени, так и в почках. Рисунок 1 показывает изменение показателей белкового обмена больных СД типа 2.

 

Рис.1. Изменение показателей белкового обмена в сыворотке крови больных СД типа 2.

 

За последние годы показано, что в патогенезе СД типа 2 ведущую роль играют различные виды цито­кинов. Под цитокинами понимают растворимые низкомолекулярные белковые или полипептидные гормоноподобные иммуномодуляторы, синтезируе­мые и секретируемые клетками иммунной системы: Цитокины являются основ­ными межклеточными медиаторами иммунной сис­темы, а также участвуют во многих физиологических и патологических реакциях организма [9].

Полученные в результате прове­денных ис­сле­дований уровни иммуноглобулинов и цитокинов приведены в таблице 3.

 

Таблица 3.

Иммунные показатели в крови больных СД типа 2.

Показатели	Контроль n=20	Больные n=76
IgA, мг/дл	187,25±4,95	367,13±17,94*
IgG, мг/дл	1151,65±36,8	2003,65±78,59*
IgM, мг/дл	151,95±7,49	271,3±6,13*
ИЛ-8, пг/мл	13,27±0,93	103,12±19,21*
ФНО-α, пг/мл	1,14±0,19	3,2±0,3*
ТФР-β1, нг/мл	2±0,23	32,73±4,56*

*p<0,001.

 

При СД 2 типа выявляются многочисленные нарушения, характерные для острой фазы ответа организма, инициируемые цитокинами ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α; эти процессы наиболее выражены при сосудистых осложнениях СД. ФНО-α выполняет регуляторные и эффекторные функции в иммунном ответе и воспалении. [9].

Также ФНО-α является индуктором ИЛ-8. ИЛ-8 низкомолекулярный цитокин воспаления, принадлежит к семейству хемокинов. Продуцируется под воздействием бактериальных эндотоксинов и цитокинов, главным образом ФНО-α и ИЛ-1. ИЛ-8 активирует нейтрофилы, в меньшей мере другие гранулярные лейкоциты, вызывает их хемотаксис в очаг воспаления. Повышенный уровень ИЛ-8 ассоциируется с хроническими и острыми воспалительными состояниями и коррелирует с тканевой инфильтрацией нейтрофилов [6].

Результаты нашего исследования (таб.3, рис.2) показывают что, содержание ИЛ-8 и ФНО-α в сыворотке крови достоверно повышается по сравнению с показателями контрольной группы, что свидетельствует о наличии глубокого воспалительного процесса у больных СД типа 2. Но надо учитывать тот факт, что повышенная концентрация ИЛ-8 может быть результатом и поздних осложнений диабета, а также субклинических (бессимптомных) инфекций. Рис.2 показывает изменение всех изученных иммунологических показателей в группе больных СД типа 2.

 

Рис. 2. Изменение иммунологических показателей в сыворотке крови больных СД типа 2.

 

ТФР-β₁ - иммуносупрессор образуется Т-лимфоцитами и моноцитами, ассоциируется наличием диабетических микро- и макроваскулярных осложнений. Этот фактор роста как предполагают, участвует в развитии диабетической нефропатии, способствуя утолщению базальных мембран и экспансии мезангии почечных клубочков. Утолщение базальной мембраны клеток эндотелия сосудов приводит, в конечном итоге, к развитию иммунного воспаления сосудистой стенки. Одной из причин, способствующее повышению сывороточной концентрации ТФР-β_1, может служить относительное состояние гипергликемии [7].

Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что активация системы иммунитета играет существенную роль в патогенезе СД типа 2. Эти иммунологические показатели могут быть успешными критериями в диагностике и лечении СД.

 

Литература

 

1.                  Архипова О.Г., Шацкая И.Н., Семенова Л.С. и др. Методы исследований в профпатологии (биохимические). М.: Медицина 1988, 208с.

2.                  Бондарь Т.П., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническая диагностика сахарного диабета и его осложнений. Москва 2003, 87 с.

3.                  Князев Ю.А., Вахрушева Л.Л., Сергеев Н.А. и др. Значение опреде­ления гли­колизированного гемоглобина и лактата плазмы для харак­теристики состоя­ния детей и подростков, больных сахарным диабетом // Педиатрия, 1987, № 9, с. 62-64.

4.                  Колб В.Г., Камышников В.С. Справочник по клинической химии (2-ое из­дание), Минск, 1982, с. 117.

5.                  Меньшиков В.В., Делектерская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. М.: Медицина 1987, 368 с.

6.                  Симбирцев А.С. Интерлейкин-8 и другие хемокины. Иммунология 1999;4;9-14.

7.                  A Pfeiffer, K Middelberg-Bisping, C Drewes and H Schatz Elevated plasma levels of transforming growth factor-beta 1 in NIDDM. Diabetes Care 1996, Vol 19, Issue 10, 1113-1117.

8.                  Joachim Spranger, Anja Kroke, Matthias Mohlig, Kurt Hoffman, Manuela Bergmann Inflammatory cytokines and the risk to develop type 2 diabetes. Diabetes vol.52, March 2003, p. 812-817.

9.                  Zhang M., Tracey KJ. Tumor necrosis factor. In: The Cytokine Handbook. Eds. A.W.Thomson. London: Acad. Press 1998;3;515-548.

 

Поступила в редакцию 09.04.2009 г.