Изучение молочнокислых микроорганизмов, выделенных из кисломолочных продуктов Казахстана

Конарбаева Зулфия Кемелхановна,

докторант кафедры биотехнологии Южно-Казахстанского государственного университета им. М. Ауэзова, Республика Казахстан.

Выделение чистых культур молочнокислых бактерий включает ряд этапов: выбор источников, отбор образцов, посев на жидкую питательную среду для обогащения молочнокислой микрофлорой, посев на плотную среду для выделения чистой культуры, пересев чистой культуры (колоний) в стерильное молоко, исследование биологических свойств выделенных штаммов в целях их идентификации и определения производственной ценности. Для выделения молочнокислых бактерий из различных источников рекомендован ряд сред. Это жидкие и агаризованные среды, в их состав входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, томатный сок, дрожжевой экстракт и автолизат, белковые гидролизаты [2].

Материалы и методы

Источниками выделения для мезофильных молочнокислых бактерий являются сырое молоко, производимые в южном регионе Республики Казахстан национальные кисломолочные продукты, в основном слабоскисшийся айран, курт, кумыс, кымыран, каймак, сузбе, а также приготовленные по разным рецептурам коже. Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 25-30°С до свертывания молока. При выделении мезофильных молочнокислых стрептококков из растительного сырья 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1:10 на физиологическом растворе.

Процесс выделения чистых культур термофильных бактерий аналогичен процессу выделения мезофильных молочнокислых стрептококков. В качестве накопительных культур использовали айран, катык, курт, сузбе и другие национальные продукты. При этом термофильные молочнокислые стрептококки и палочки культивируют при 40-43 °С, за исключением ацидофильной палочки, которую выращивают при 37 °С. После проверки сгустка на типичность органолептических свойств и микрофлоры полученную обогащенную культуру, выращенную на стерильном молоке, высевают на плотную питательную среду (агар с гидролизованным молоком). Посевы термостатируют в течение 48 ч.

Выделенные высокоактивные штаммы микроорганизмов позволят получить закваску с необходимыми пробиотическими свойствами. Предпочтение отдавали тем культурам, которые обладали достаточно высокой активностью сквашивания молока, значительной антагонистической активностью, устойчивостью к антибиотикам. Штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из различных источников, микроскопировали и изучали их активность при свертывании молока и органолептические показатели. Для выделения чистой культуры в качестве твердой питательной среды использовали гидролизованное молоко с агаром и среду MRS.

Результаты исследований

В результате проделанной работы из различных национальных молочных продуктов были выделены 207 колоний, из которых в дальнейшем, использовались только 25 колоний, как наиболее часто встречающиеся, следовательно, более адаптированых к местным условиям.

По-видимому, использование молочной продукции южного региона оказало существенное вляние на оптимальный и предельный температурный рост. Среди исследуемых культур преобладают термолабильные и термофильные организмы (SSh-23, АТ-3, IT-2, ТК-23, ZT-27. KL-21, KuA-16, KuS-12).

Выраженная способность к продуцированию молочной кислоты является одним из наиболее известных биологических свойств молочнокислых бактерий, которая рассматривается в качестве одного из основного параметра, характеризующего их биохимическую и антагонистическую активность [1]. Это один из важных факторов антагонизма в отношении других видов микробов. Активность кислотообразования является нормируемым показателем специфической активности лактосодержащих пробиотиков и соответственно критерием отбора штаммов лактобактерий при разработке новых бактерийных препаратов [4].

Селекцию новых штаммов, в дальнейшем планируемые использовать как пробиотики, проводили по таким параметрам как продолжительность свертывания и кислотообразующая активность. Штаммы, титруемая кислотность которых колеблется в пределах 20-80°Т, считаются неактивными, а те у которых этот параметр свыше 120°Т высокоактивными [7].

Полученные в результате экспериментальных работ данные свидетельствуют о хорошей кислотообразующей способности у большинства исследуемых штаммов.

Несмотря на то, что именно воздействие молочной кислоты рассматривают как выраженное бактерицидное свойство, однако, по мнению многих авторов полной аналогии между интенсивностью кислотообразования и антагонистической активностью молочнокислых бактерий не происходит [1; 5].

В таблице 1 представлены данные об основных культуральных и физиологических свойствах выделенных штаммов.

Таблица 1.

Основные культуральные и физиологические свойства выделенных штаммов.

Устойчивость выделенных штаммов к желчи является косвенным показателем жизнеспособности клеток, которая возможно обеспечит их поступление в кишечную зону и реализацию пробиотических их свойств. Это связано с тем, что пробиотик, прежде чем достигнуть толстого кишечника, должен выжить при проходе через желудок. Неблагоприятное действие желудочного сока является основным барьером, который необходимо преодолеть выделенным и вносимым бактериям. Среди молочнокислых бактерий наиболее кислотоустойчивыми являются лактобактерии, которые обладают достаточной степенью резистентности к кислому содержимому желудка [3, 6]. Наибольшее содержание микроорганизмов наблюдается в толстой кишке. Здесь их концентрация достигает 10¹⁰-10¹¹ и более на 1 г содержимого.

Нами были проведены эксперименты по определению устойчивости выделенных штаммов к соляной кислоте. В жидкую среду MRS, засеянную тестируемыми бактериями, вносили соляную кислоту, устанавливая значения рН от 4,5 до 6,5. Установлено, что значительное количество выделенных культур обладают достаточной устойчивостью к кислой среде. Лишь отдельные культуры, такие как СС-2, СPz-1 показали низкий рост при внесении соляной кислоты.

Устойчивость к низким значениям рН – одна из основных характеристик для пробиотических бактерий [10]. Бактерии вместе с пищей попадают в неблагоприятные для них условия желудка. Хотя подавляющие условия желудка вызваны pH близкой к 1,5, в большинстве случаев, в лабораторных условиях in vitro выбирают обычно pH 3.

Рисунок 1 показывает способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (pH 3).

Рис. 1. Способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (pH 3).

Следующие штаммы SSh-23, Sha-2, IT-2, CC-2, KK-31, SSa-1, KuA-16 и K-3 показывают значительную устойчивость к низким рН. Данные штаммы не только устойчивы к кислой среде, но и способны к дальнейшему росту и размножению. Некоторые штаммы обладают более низкой способностью к развитию в кислой среде, однако необходимо отметить, что выращенные культуры, в целом, показывают хорошую устойчивость к низким рН.

Желудок и верхняя часть тонкой кишки почти свободны от бактерий, так как бактерии, поступившие извне с пищей, почти полностью уничтожаются соляной кислотой, содержащейся в желудочном соке. Одним из основных требований к современному пробиотическому препарату, является его устойчивость к действию желчи и желудочного сока.

Желчь выделяется в тонкой кишке и присутствие желчи создает неблагоприятные условия для большинства бактерий. Желчные соли уменьшают выживание бактерий, поскольку взаимодействуют с клеточной мембраной бактерий, в которой основные компоненты – липиды и жирные кислоты. Блокирующее воздействие отрицательно влияет на проницаемость клетки [8].

Суточная культура была внесена нами в среду бульона MRS, содержащую концентрат желчи 0,3% и 0,5%. Бактериальный рост анализировался путем подсчета жизнеспособных колоний после 0, 2 и 4 часа культивирования и при дальнейшем инокулировании в агаризованную среду при 37^oC в течении 48 часов. 0,1 мл раствора, который содержал определенный, ранее выделенный штамм был добавлен в 10 мл бульона MRS, затем был инокулирован 24 часа при 37^oC.

Рисунок 2 показывает выживание молочнокислых бактерий в среде содержащей 0,3 % и 0,5% желчных солей.

а)                                                                                                  б)

Рис. 2. Выживание молочнокислых бактерий в среде, содержащей а) 0,3% желчных солей, б) 0,5% желчных солей.

Наиболее устойчивыми к кислой среде оказались штаммы KSh-12, ZT-27, KK-31, Spa-1, SSa-1, KuA-16, K-3.

Средняя концентрация желчи в кишечнике - 0,3% и время нахождения пищи в тонкой кишке приблизительно 4 часа [9]. Проведенные опыты показывают значительную устойчивость выделенных культур к действию желчи.

В ходе изучения морфологических признаков мы убедились, что клетки всех исследуемых культур были неподвижны, не содержали спор, окрашивались положительно по Граму и были каталазонегативны. По этим признакам они являются типичными представителями семейства молочнокислых бактерий.

Приведенные морфологические и культуральные свойства молочнокислых бактерий использовали для их идентификации. Способность молочнокислых бактерий к сбраживанию углеводов сильно варьирует при изменении условий культивирования, но данный признак можно рассматривать как вспомогательный при их идентификации, поэтому у выделенных микроорганизмов была изучена и сбраживаемая углеводная способность.

В соответствии с определителем Bergey выделенные молочнокислые бактерии были отнесены к роду Streptococcus и Lactobacterium. Изученные культуральные и морфологические признаки клеток дали возможность определить видовую принадлежность исследуемых штаммов: из 25 штаммов 5 штаммов являются представителями Lac lactis; к S. thermophilus относятся 6 штаммов; к L. аcidophilus относятся 5 представителей; к представителям Lbm. bulgaricus мы отнесли 5 выделенных штаммов. Две культуры были отнесены к Lbm. рlantarum и два выделенных штамма к Lbm. Casei.

Литература

1.         Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2004. - № 6. – С. 37-39.

2.         Гудкова М.Я. Технология бифидосодержащих молочных продуктов: Автореф. дис. канд. техн. наук. - Л., 2006, 16 с.

3.         Ленцнер А.А., Микельсаар М.Э., Воронина М.Н. О количественном составе микрофлоры кала здоровых взрослых при обычном питании // 16 научная сессия ин-та питания АМН СССР: Тез. докл. – М., 1966. – С. 153-154.

4.         Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника. Медицина, 2007. – 216 с.

5.         Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: дис. … канд. мед. наук. - М., 1990. – 146 с.

6.         Чернякова В.И., Смирнова Т.В. Влияние желчи на интестинальные аэробные бактерии // Врач. дело. – 1978. - № 10. – С. 87-91.

7.         Эйсфельд Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий: дисс…. канд. биол. наук. – 2002. – 129 с.

8.         Gilliland, S.E, Staley, T.E., and Bush, L.J. 1984. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct. J. Dairy Sci. 67: 3045-3051.

9.         Prasad, R.; Sankhyan, S. K.; Karim, S. A., 1998. Growth performance of broiler rabbits fed on diets containing various types of protein supplements. Indian J. Anim. Prod. Manage., 14 (4): 227-230.

10.     Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. and Matilla S. T. 2000. Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology 84: 197-215.

Поступила в редакцию 20.08.2014 г.